PH1788 | 血液线粒体DNA提取试剂盒 Blood Mitochondrial DNA Extraction Kit

一，试剂盒组份

组份 (50T) (100T) 保存温度
DNase I 12mg 12mg*2 -20℃溶解后分装
RNase A 0.5ml 0.5ml*2 -20℃保存 经常使用可2-8℃放置
红细胞裂解液（10X） 100ml 100ml*2 2-8℃
细胞裂解液 50 mL 100 mL 2-8℃
线粒体清洗液 25 mL 50 mL 2-8℃
DNA酶反应液 6ml 12ml 2-8℃
线粒体裂解液 10ml 20ml 常温放置，如有沉淀可37℃水浴
蛋白沉淀液 7.5ml 15ml 2-8℃
核酸助沉剂 0.5ml 1ml 2-8℃
TE缓冲液 25ml 50ml 2-8℃

二，保存条件

本试剂盒整体保存于2-8℃一年，DNASE I和RNase A  -20℃保存。使用前，在DNASE I中加入600ul的DNA酶反应液，溶解分装后-20℃保存三个月，溶解后的DNASE I如果超过三个月，活性可能会降低，请自行订购DNASE I。线粒体裂解液使用前常温保存，如有沉淀可37℃水浴溶解，不影响使用。

三，说明

本试剂盒可用于从血液中分离完整而纯化的线粒体DNA。

线粒体DNA提取的关键是尽可能的去掉核DNA。本试剂盒利用差速离心得到比较纯净的线粒体，再利用DNA酶消化和裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA，最后得到纯净的线粒体DNA。可用于PCR等对纯度要求较高的实验。

四，操作步骤

准备工作：在12mg DNASE I中加入600ul的DNA酶反应液，适当分装后-20℃保存。红细胞裂解液（10X）用双蒸水稀释10倍成工作液（如标本为有核红细胞血液，此试剂用不上，需自备生理盐水或者PBS）。线粒体裂解液保存于常温，如有沉淀37℃水浴溶解。离心机温度下降到4℃（2-8℃），如无低温离心机，也可以常温离心，并将所有离心时间为10min的改为5min，但最后所得DNA品质及产量会有一定影响。

1. 血液处理：

血液要求：非肝素钠抗凝血，最好使用新鲜血液。对于陈旧血液，由于冻凝过程中冰晶已经对细胞核膜和线粒体膜产生损伤，所以线粒体DNA得率会大大减少。

a. 对于无核红细胞全血（如哺乳动物处周血），取血约3-5ml（适当分成几管），加入3倍体积的红细胞裂解液（稀释后的工作液,下同），混匀，800 × g  5 min离心收集白细胞。加入1-2ml红细胞裂解液（稀释后的工作液），吹打重悬白细胞，合并于一管中，800 × g 5~10 min离心收集白细胞。此时如果白细胞有可见红色，可再次用少量(0.5ml)红细胞裂解液洗细一次。

b. 对于有核红细胞全血（如禽类全血），取约300-500ul全血，800 × g 5~10 min离心收集全细胞，用生理盐水或者PBS清洗两次，留沉淀去上清。清洗时请用去尖吸头吹打。

2. 在收集到的细胞中，加入1.0 mL冰预冷的细胞裂解液重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨20~40次；

3. 匀浆物转移到离心管，4℃，1000× g 离心5 min；

4. 取上清，加入一新的离心管中，4℃，1000× g 再次离心5 min（一共两次离心，完整去核）。

5．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 12,000 × g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底；

6. 在线粒体沉淀中加入0.5 mL 线粒体清洗液重悬线粒体沉淀，4℃，1000× g 离心5 min；

7．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 12,000 × g 离心10 min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；

8. 加入100ul DNA酶反应液重悬线粒体，吹打均匀后，再加入10ul DNASE I溶液（见准备工作），混匀，37℃水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA。4℃， 12,000 × g 离心5 min。尽可能的弃上清，再加入200ul TE 重悬线粒体沉淀，4℃， 12,000 × g 离心5 min，洗去残留的DNA酶。

9.得到的沉淀，用200ul TE缓冲液重悬线粒体沉淀，加入10ul  RNase A。加入200ul线粒体裂解液，轻轻混匀（不可吹打），放置1-2min，再加入150ul蛋白沉淀液，迅速混匀。4℃， 12,000 × g 离心5 min。此步骤可进一步去除核DNA。

10．取上清，加入一新的离心管中（如用于酶切分析，可加入此步：选用等体积的酚氯仿异戊醇25:24:1抽提一次，再用氯仿抽提一次，或者直接用氯仿抽提两次，一般来说，此步可去掉一些微量蛋白及糖类，但会造成线粒体DNA的损失，因而用于PCR时可省，并不影响后续实验），加入0.6倍体积的异丙醇（如无异丙醇，可加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA，如离心管太满可分两管）及5-10ul 核酸核酸助沉剂，混匀，-20℃沉淀半小时左右（此步可省），4℃， 12,000 × g 离心10 min。

11. 弃上清，再加入1ml  70%乙醇清洗，4℃， 12,000 × g 离心5min。重复用70%乙醇洗一次。

12. 弃上清，再次离心1min 吸弃上清，不要碰到管底，开盖凉干约5-10min。

13．加入10-20ul TE缓冲液,轻弹管底，37℃水浴5分钟，线粒体DNA溶解。

14. 进行DNA检测及-20℃保存，进行下步的实验。

以上方法可以比较完整的去掉核DNA（达到PCR无法检测的级别）但过程复杂，线粒体DNA丢失较多，以下为简单方法，也可以比较好的提到线粒体DNA，在裂解时间合适的情况下，也能去核DNA（达到电泳检测不到的级别）。

1．血液常规处理（红细胞裂解或者全血清洗）

2．200ul TE缓冲液重悬全细胞，加入10ul  RNase A，加入200ul线粒体裂解液，轻轻混匀（不可吹打），放置2-3min，再加入150ul蛋白沉淀液，迅速混匀。4℃， 12,000 × g 离心5 min。

3．取上清，接上面第10步，氯仿抽提，乙醇沉淀。

四 注意事项：

1. 为保证获得完整及尽可能多的线粒体，匀浆条件要示：第一是全程低温操作。第二是快速。第三，如有条件可将匀浆后的碎片在显微镜下观察。

2．线粒体DNA本身含量很低，如果电泳检测不到，可加大上样量，用更少量的TE溶解沉淀，或者直接进入PCR检测。

2. 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。

一般低温离心机都有离心力显示，如果没有，可以用以下公式简单的换算。

转速与离心力换算

G＝1.11×(10^-5)×R×[rpm]^２

G为离心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍数来表示；

 [rpm] ^２即：转速的平方； R为半径，单位为厘米。