PH0232 | 动物组织/细胞总RNA提取试剂盒 Total RNApure Kit （离心柱型）

产品简介

改进的异硫氰酸胍/酚一步法裂解细胞和灭活RNA 酶， 然后总RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤, 漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除， 最后低盐的RNase free water将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。


产品特点

1.  离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

2.  结合了异硫氰酸胍/酚一步法试剂稳定性好，纯度高和离心柱方便快捷的优点，不需要异丙醇沉淀和乙醇洗涤过程，RNA可以直接从离心柱上洗脱避免了过度干燥不易溶解问题。

3.  独有的R裂解液配方，可以有效的消除基因组污染。

4.  多次漂洗去蛋白过程，提取RNA纯度更高。

5.  有效的去除了5S在总RNA中含量，提高了纯度。


注意事项

1. 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

2.  为防止RNA降解，所有离心步骤如未加说明，均在4℃低温进行。使用转速可以达到13，000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

3.  裂解液R中含有刺激性有害化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

4.  考虑到环保问题，本试剂盒不含有实验室常用试剂氯仿，用户使用前需要自备氯仿。

5.  常规的琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳均可以用来分析RNA的质量。好的RNA产物在电泳后应该可以看到明显的二条优势核糖体RNA带，分别为~5Kb（28S），~2Kb（18S），条带亮度比值约为2：1。有时候也可以看到~0.1kb和0.3Kb(5S，tRNA)带。但有时候根据不同的物种如某些植物组织可以看到4，5条带也属于正常现象，如果RNA未成熟的前体或者不均一核RNA、小核RNA提取出来也可能看到介于7Kb和15Kb之间的不连续的高分子量条带。

6.  检测OD260/OD280吸光度比值时，RNA样品应该溶于TE后检测，如果用水稀释后检测，由于一般水离子强度和PH值低，会使OD280升高，从而使比值降低。

7.  加入裂解液R匀浆后，加氯仿前，样品可在 –60℃-70℃ 保存一个月以上。

储存和稳定性

1.  所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。

2.  不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。裂解液R可以常温运输，收到后4℃避光保存。

3.  避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

操作步骤

提示：第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量乙醇! 

1.  匀浆处理

a.  组织：用玻璃或强力匀浆器搅匀组织样品，保存于液氮内样品需要用研钵磨碎，每50~100mg组织加1ml的细胞裂解液R后匀浆。组织样品容积不能超过细胞裂解液R容积的10%。

b.  单层生长的细胞：直接往直径3.5 cm的培养板中加入1ml的细胞裂解液R溶解细胞，并用移液枪轻轻吹打混匀。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的细胞裂解液R量（每10cm2加1ml）。一般情况下，普通大小的细胞培养瓶，加入1ml的细胞裂解液R , 迅速轻摇使细胞裂解液R充分和瓶底所有细胞接触裂解细胞并灭活RNA酶，轻轻用移液枪反复吹打混匀。当细胞裂解液R量不足时可导致抽提的RNA中污染有DNA。 

c.  悬浮生长的细胞：通过离心来沉淀细胞。在细胞裂解液R试剂中用移液枪反复吹打来裂解细胞。每5~10×106的动物细胞，植物或酵母菌细胞或每1×107细菌加1ml的细胞裂解液R。在加入细胞裂解液R前应避免洗涤细胞，否则会增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器。

2.  将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。

3.  可选步骤：4°C的条件下12，000rpm 离心10分钟，小心取上清转入一个新的RNase free的离心管中。当样品富含蛋白质、脂肪、多糖或是细胞外物质例如肌肉。脂肪组织或植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。匀浆化后在2~8°C的条件下以12,000rpm离心10分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细胞外膜、多糖、以及高分子量DNA，而上层的超浮游物含有RNA。

4.  每1ml细胞裂解液R 加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。

5.  于4℃12，000rpm 离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加细胞裂解液R体积的60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作。

建议：分层后细胞裂解液对RNA的保护作用减弱，因此操作上快些低温更好。由正中插入液面下缓慢吸取大约460ul上相，避免扰动带Rnase的中间层；一般吸取大约500ul上相即可，不必要尽可能多的吸取含RNA的水相。

6.  加入0.5倍体积无水乙醇，颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱中（吸附柱套在收集管内）。

7.  12，000rpm 离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。

8.  加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心45秒，弃掉废液。

9.  加入500μl漂洗液RW，12,000 rpm 离心45秒，弃掉废液。

10. 将吸附柱放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

11. 取出吸附柱，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50-80μl  RNase free water， 室温放置2分钟，12,000 rpm 离心1分钟。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要RNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积最好不少于30μl，体积过小降低RNA洗脱效率，减少RNA产量。

12.  电泳推荐方案：用3mm×1mm小梳子，初始量为5ul电泳。电泳电压4-10v/cm，电泳时间20-25分钟。