PH0324 | 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒 Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit

存储 冰袋运输，-20℃存储。有效期12个月。常温状态下可保存一周，2-8℃可以保存一个月。

产品简介

膜蛋白与浆蛋白抽提试剂盒(Membrane and Cytosol Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便地从培养细胞或组织中抽提细胞膜蛋白和细胞浆蛋白的方法。抽提的膜蛋白不仅包括质膜上的膜蛋白，也包括线粒体膜、内质网膜和高尔基体膜等上的膜蛋白,通过匀浆适度破碎细胞，经低速离心去除细胞核和少数未破碎的细胞产生的沉淀，随后取上清高速离心获得细胞膜沉淀和含有细胞浆蛋白的上清，然后通过优化的膜蛋白抽提试剂从沉淀中抽提获取膜蛋白。

约90分钟即可完成培养细胞或组织的细胞膜蛋白与细胞浆蛋白的分离和抽提。抽提得到的蛋白可以用于SDS-PAGE，Western、酶活性测定等后续实验。不适合用于蛋白酶、磷酸酯酶等受这些抑制剂影响的酶的活性测定。

操作步骤

注意：裂解蛋白的所有步骤都需在冰上或 4℃进行。PMSF需要在抽提前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。

使用说明：

1.准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后后立即放置在冰上，混匀。取适当量的浆蛋白由提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。取适当量的核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF使PMSF的最终浓度为1mM。

2. 贴壁细胞：用预冷的PBS洗一遍，用细胞刮刀刮下细胞，或用EDTA溶液处理细胞，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。

3.悬浮细胞：用预冷的PBS洗一遍，离心收集细胸、尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

3. 每20μl细胞沉淀加入200μl浆蛋白抽提试剂（使用前加入终浓度为1mM的PMSF）与1μL DTT。例如：对于二百万Hela细胞，其细胞沉淀的体积大约为20μl或40mg。

5.最高速剧烈Vortex 5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。（如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长vortex时间。)

6.冰浴10-15分钟。

7.最高速剧烈Vortex5 秒，4℃ 12000-16000g离心5分钟。

8. 立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存。（千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。）

9.对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入50μl添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。）

10.最高速剧烈Vortex 15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex 15-30秒，共30分钟。

11.4℃ 12,000-16,000g离心10分钟。

12.立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃冻存。

对于新鲜组织：

1.把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照20:1的比例混合适当量的浆蛋白抽提试剂（例如200ul浆蛋白抽提试剂中加入10ulDTT溶液）。并加入PMSF至最终浓度为1mM配制成组织匀浆液。每60mg组织加入200μl组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液，冰浴或4℃进行匀浆。

2.匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，冰浴放置15分钟。

3. 4℃ 1,500g离心5分钟。把上清转移至一预冷的塑料管中，为抽提得到的部分细胞浆蛋白。(吸上清时千万不要触及沉淀。)

4.对于沉淀，到了这一步已经充分匀浆，但很多细胞还没有破碎。接下去按照使用说明的步骤4开始操作，即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作，按照步骤4至步骤12抽提得到细胞浆蛋白和细胞核蛋白。

注意事项

1．裂解得到的蛋白样品，由于含有较高浓度的去垢剂干扰，不能用 Bradford 法测定蛋白浓度，可以选用本公 司生产的 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

2．对于组织样品，本试剂盒适用于新鲜组织，对冻存组织抽提效果较差。

3．为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。